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Stickstoffmonoxid (Stickoxid)
Stickstoffmonoxid ist ein farbloses Gas, das unter Arginin-, Sauerstoff- und NADPH-Verbrauch von der Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS) synthetisiert wird, wobei schlußendlich als stabiles Endprodukt Nitrit und/oder Nitrat entsteht. Stickstoffmonoxid besitzt ein ungepaartes Elektron, ist (elektrisch) neutral und diffundiert durch cytosolische und membranöse Kompartimente. Trotz seiner radikalischen Eigenschaften hat Stickstoffmonoxid eine ungewöhnlich lange Halbwertszeit von 2 – 3 s in biologischen Systemen und von etwa 400 s (bei einer Konzentration von 1 µM) in reinem Wasser (Hakim, Sugimori et al. 1996). Mathematische Modelle erlauben dabei den Schluß, daß Stickstoffmonoxid - von einer punktförmigen Quelle für einige Sekunden freigesetzt - in biologischen Systemen etwa 200 µm diffundieren kann (Wood & Garthwaite 1994). Es wurde vorgeschlagen, daß Stickstoffmonoxid das einzig bisher bekannte Radikal ist, welches unter biologischen Bedingungen eine ausreichende Stabilität besitzt, um als extrazellulärer ‚Messenger‘ zu fungieren. Zu den physiologischen Wirkungen des Stickstoffmonoxids zählen Vasodilatation, Redoxregulierung am NMDA-Rezeptor, Hemmung der Thrombocytenaggregation, Verstärkung synaptischer Lernprozeße sowie zahlreiche immunmodulatorische Effekte.
Superoxid
Der durch die Entwicklung der oxigenen Photosynthese bewirkte Umschwung von einer reduktiven zu einer oxidativen Atmosphäre hat komplexe Mechanismen zur effektiven Nutzung von Sauerstoff hervorgebracht. Die wohl bedeutendste Erweiterung ist die Verwendung des Sauerstoffs im Energiestoffwechsel als terminaler Akzeptor in der Atmungskette gewesen. Der Umgang mit Sauerstoff führte aber auch zu einer erhöhten Produktion sogenannter aktivierter Sauerstoffformen, die potentiell toxisch sind. Bereits vor Jahrzehnten wurde darauf hingewiesen, daß die Toxizität eines erhöhten Sauerstoff-Partialdrucks auf der Bildung von Sauerstoff-Radikalen beruht (McCord & Fridovich 1969).
Übersicht 3: Aktivierung des Sauerstoffs durch univalente Reduktion
Molekularer Sauerstoff ist ein Biradikal mit zwei ungepaarten Elektronen und bildet sich im Magnetfeld als paramagnetisches ‚Triplett‘ ab. Allerdings ist die Reaktivität des Sauerstoffs herabgesetzt (Pauli-Prinzip), da die beiden ungepaarten Elektronen in verschieden Orbitalen vorkommen und denselben parallelen Spin haben. Dies beschränkt mögliche Reaktions-Partner auf solche mit zwei ungepaarten Elektronen und antiparallelem Spin. Die Aktivierung des Sauerstoffs beruht auf der Tatsache, daß eine Reaktion des Triplett-Sauerstoff mit Radikalen oder einzelnen Elektronen keiner Spinrestriktion unterliegt. Aus molekularem Sauerstoff entsteht so Superoxid durch reduktive Aufnahme eines Elektrons in eines der antibindenden p-Orbitale. Durch weitere nachfolgende 1-Elektronenübergänge entstehen Wasserstoffperoxid, das Hydroxylradikal und schließlich Wasser (Übersicht 3).
Vermutlich entsteht Superoxid unter physiologischen Bedingungen vorwiegend in den Mitochondrien. Zu beachten ist jedoch, daß reaktive Sauerstoffspezies nicht bei der 4-Elektronen-Reduktion von Sauerstoff zu Wasser durch die Cytochromoxidase (Komplex IV) freigesetzt werden. Die hierbei entstehenden Sauerstoffintermediate sind so fest gebunden, daß weder Sauerstoffradikale noch Wasserstoffperoxid freigesetzt werden (Antonini, Brunori et al. 1970). Allerdings wird durch die Elektronentransportkette (Komplex I und III) molekularer Sauerstoff (etwa 2 – 3 % des Sauerstoffverbrauchs (Boveris, Oshino et al. 1972)) schrittweise durch sogenannte ‘leak’-Elektronen reduziert, und das so entstehende Superoxid wird in das umgebende Medium freigesetzt (Reilly & Bulkley 1990).
Superoxid entsteht zum anderem durch die Aldehyd-Oxidase, die mitochondriale NADH-Dehydrogenase, die Cytochrom-P450-Reduktase als auch durch die Autoxidation von Hämoglobin, Glyceraldehyd, reduzierten Riboflavinen (wie FMN und FAD), Catecholen, Tetrahydropterinen und Thiolverbindungen. Eine weitere Quelle des Superoxids sind Xenobiotica, die durch das sogenannte ‚Redoxcycling‘, bei dem zelluläre Reduktionssysteme diese Verbindungen reduzieren und ein Elektron auf Sauerstoff übertragen. Dieser Mechanismus kann nicht nur relevante Mengen an Superoxid produzieren, sondern auch zu einer Depletion der zellulären Reduktionsequivalente (NADPH, GSH) führen (Kappus & Sies 1981).
Unter pathologischen Zuständen kann Superoxid zudem von der in vielen Zelltypen vorkommenden Xanthin-Oxidase und der NADPH-Oxidase der Immunzellen produziert werden. Die cytosolische Xanthin-Oxidase entsteht, insbesondere im Verlauf der Ischämie, durch Proteolyse (irreversibel) oder durch die Oxidation von Thiolgruppen (reversibel) aus der Xanthin-Dehydrogenase, einem Enzym des Harnsäurestoffwechsels, das nach Konversion nicht mehr NAD+, sondern Sauerstoff als Elektronenakzeptor verwendet (Nishino, Nakanishi et al. 1997). Die NADPH-Oxidase ist ein in Neutrophilen, Makrophagen und Mikrogliazellen lokalisiertes Enzym, das im aktiven Zustand membranständig ist und durch eine sehr effektive Superoxidproduktion (teilweise zusammen mit dem cytosolisch produzierten Stickoxid) zum ‚oxidative burst‘ als Teil der Immunantwort beiträgt.
Wasserstoffperoxid entsteht durch die Dismutation von Superoxid, d. h. durch eine Reaktion zweier gleicher Moleküle mittlerer Oxidationsstufe, bei denen das eine oxidiert und das andere reduziert wird. Die Dismutation verläuft entweder spontan oder wird durch die Superoxiddismutase (SOD) enzymatisch katalysiert. Wasserstoffperoxid ist um Größenordnungen weniger reaktiv und damit stabiler als Superoxid und, da es im Gegensatz zu diesem keine Ladung trägt, für biologische Membranen hochpermeabel.
Das Hydroxylradikal, als das stärkste in biologischen Systemen auftretende Oxidans, entsteht hier durch die metallkatalysierte Disproportionierung (Fentonreaktion) von Wasserstoffperoxid (Übersicht 4).
Übersicht 4: Mechanismus der Fentonreaktion
Infolge seiner hohen Reaktivität diffundiert das Hydroxylradikal im Mittel nur wenige Moleküldurchmesser, bevor es reagiert und wirkt somit ‚ortsspezifisch‘ in der nächsten Umgebung seiner Entstehung (Pryor 1986). Superoxid besitzt hier eine wichtige Funktion, da es in der Lage ist, komplexiertes Fe3+ zu Fe2+ zu reduzieren und somit erneut für die Fentonreaktion zu Verfügung zu stellen. Daneben kann Superoxid auch durch eine direkte Reaktion mit Wasserstoffperoxid das Hydroxylradikal erzeugen (Haber-Weiss-Reaktion), jedoch ist diese Reaktion sehr langsam und spielt in biologischen System kaum eine Rolle (Buettner 1993).
Peroxynitrit
Peroxynitrit entsteht durch die diffusions-kontrollierte Reaktion (Geschwindigkeitskonstante: 6,7 x 109 mol-1 s-1) zwischen Stickoxid und Superoxid (Huie & Padmaja 1993). Diese Reaktion ist dreimal schneller als die enzymatische Disproportionierung des Superoxids durch die Superoxiddismutase (SOD) bei neutralem pH . Peroxynitrit ist als deprotoniertes Anion (ONNO-) bei stark alkalischem pH stabil, wird jedoch bei neutralem pH protoniert, und die Säure (ONOOH) zerfällt mit einer Halbwertszeit von etwa 1,3 s bei 25 °C (Koppenol, Moreno et al. 1992). Die Zerfallswege sind zur Zeit Gegenstand einiger Kontroversen, ebenso wie die Frage, ob Peroxynitrit selbst oder ein Intermediat für die Reaktivität verantwortlich ist . Hinreichend geklärt ist allerdings, daß zum einen Nitrat als Endprodukt und zum anderen das hochreaktive Hydroxylradikal entstehen können. Da Peroxynitrit aus zwei relativ schwachen Oxidantien entsteht und hinreichend stabil ist, um einige Zelldurchmesser weit zu diffundieren, multipliziert sich darüber die Toxizität seiner Ausgangsmoleküle (Crow & Beckman 1995). Wie andere Oxidantien kann auch Peroxynitrit Lipide, Proteine und DNA oxidieren, allerdings aufgrund seines hohen Redoxpotentials sehr effektiv. Eine spezifische Reaktion ist dagegen die elektrophile Nitrierung am aromatischen Ring des Tyrosins (Beckman, Ischiropoulos et al. 1992), die in Anwesenheit von Kohlendioxid verstärkt abläuft (Gow, Duran et al. 1996). Die Konzentration des Kohlendioxids im Gewebe liegt typischerweise bei 1 mM (Arteel, Briviba et al. 1999), jedoch kann unter pathologischen Zuständen dieser Wert erheblich überschritten und dadurch die Entstehung von Nitrotyrosin drastisch gefördern werden (Radi 1998). In jüngster Zeit wurde für die Glutathionperoxidase eine Funktion als Peroxynitrit-Reduktase nachgewiesen. Dies stellt möglicherweise einen entscheidenen protektiven Mechanismus dar, zumal die Glutathionperoxidase in aktivierten Mikrogliazellen verstärkt exprimiert wird (Lindenau, Noack et al. 1998).