StickstoffmonoxidFreie Radikale
Freie Radikale im Allgemeinen
Die Überproduktion reaktiver Stickstoff- und Sauerstoffspezies wird bei ganz unterschiedlichen Erkrankungen als ein entscheidener Faktor in der Ereigniskaskade, die letztlich zum Zelltod führt, angesehen. Neben Stickstoffmonoxid (auch Stickoxid genannt), Superoxid und deren Reaktionsprodukt Peroxynitrit sind insbesondere das Hydroxylradikal (.OH), organische Radikale (R.) sowie die Oxidantien Wasserstoffperoxid (H2O2) und Hypochlorsäure (HOCl) von Bedeutung.
Allgemein werden diese Spezies als ROS (reactive oxygen species) erfaßt, oder, wenngleich begrifflich zum Teil nicht korrekt, als ‚freie Radikale‘, bezeichnet. Im Sinne der Definition sind freie Radikale Moleküle oder Atome, die durch das Vorkommen eines oder mehrerer ungepaarter Elektronen charakterisiert sind und unabhängig existieren können. Sie sind im Allgemeinen sehr reaktionsfreudig, und die Reaktionen sind zumeist irreversibel. Freie Radikale entfalten ihre destruktive Wirkung in den Zellen des Körpers vor allem durch Proteinmodifikation, Hemmung der mitochondrialen Atmungskette, DNA-Schädigung und Fettsäureoxidation.
Freie Radikale im Gehirn (ZNS)
Die das ZNS charakterisierenden zellulären Elemente sind im Wesentlichen die Neuronen und Gliazellen, wobei erstere als das zelluläre Korrelat der kognitiven Fähigkeiten des ZNS betrachtet werden. Zweien der drei Gliazelltypen werden dabei hauptsächlich (unter-) stützende Aufgaben zugedacht (griechisch Glia = Leim). Die Oligodendroglia (Oligodendrocyten) ermöglicht durch Myelinisierung der neuronalen Axone eine schnelle Signalweiterleitung. Die Astroglia (Astrozyten) dient wesentlich der metabolischen Versorgung der Neurone, wobei sie neueren Befunden zufolge auch an der synaptischen Transmission beteiligt ist.
Der dritte Gliatyp, die Mikroglia, verdankt ihren Namen einer relativ geringen Größe. Sie ist vermutlich mesodermalen Ursprungs und damit von den ektodermalen Astrozyten, Oligodendrozyten und Neuronen grundverschieden. Die Mikrogliazellen werden als Makrophagen des Gehirns angesehen, einem Organ, das ‚immunologisch privilegiert‘ ist, in dem Sinne, daß es an Immunreaktionen des Organismus nicht direkt beteiligt ist, da durch die Bluthirnschranke bzw. das Fehlen eines lymphatischen Systems das Einwandern von immunkompeten Zellen normalerweise verhindert wird. Die Mikroglia stellt etwa 20 % der gesamten Gliapopulation, wenngleich ihre Anzahl zwischen einzelnen Hirngebieten beträchtlich schwankt. Ihre Funktion besteht während der frühen postnatalen Entwicklung in der Phagozytose der, im Zuge der physiologischen, teilweise erfahrungsbedingten, Modellierung des Gehirns, sterbenden Neurone (in einigen Kerngebieten bis zu 50 % der neuronalen Population). Ihre Aufgabe im gesunden adulten Gehirn ist jedoch ziemlich unklar. Die ramifizierte, durch feinverzweigte Fortsätze charakterisierte Morphologie der ‚ruhenden‘ Mikroglia vermag sich jedoch unter pathologischen Bedingungen teilweise innerhalb weniger Stunden dramatisch zu verändern. Die Mikroglia wird ‚aktiviert’, entwickelt eine amöboide Morphologie, und ähnelt jetzt, wie auch schon in der postnatalen Periode, sowohl unter biochemischen als auch funktionellen Aspekten, den Makrophagen.
Aktivierte Mikrogliazellen lassen sich, mehr oder weniger regional begrenzt, bei einer Vielzahl von Erkrankungen des Nervensystems finden. Dazu zählen die Parkinsonsche und Alzheimersche Krankheit, die amyotrophe Lateralsklerose (ALS) sowie Ischämie, Infektionen (bakterielle und virale) und mechanische Traumata. Neben regenerativen Effekten, die auf der Freisetzung von Wachstumsfaktoren sowie der Phagozytose sterbender Neurone beruhen, sind aktivierte Mikroglia jedoch auch toxische Mediatoren. Inflammatorische Cytokine als auch reaktive Stickstoff- und Sauerstoffspezies sind Schlüsselelemente in der Initiierung einer sekundären Gewebeschädigung. Gerade hier wird in jüngster Zeit verstärkt ein Ansatz zur, eben auch klinischen, Intervention gesucht, um die den primären ‚Insult‘ überlebenden Neurone einer autodestruktiven Schädigung zu entziehen.
Messung reaktiver Stickstoffspezies
Allgemein ist festzuhalten, dass die quantitive Messung von „freien Radikalen“ in biologischen Systemen äußerst schwierig ist, da sich diese durch ihre Reaktionsfähigkeit einer genauen Beobachtung entziehen.
Biochemischer Messung
Die Produktion des Stickstoffmonoxids in den Zellen des Körpers kann indirekt durch die Bestimmung der bei der Synthese entstehenden Koprodukte, wie Citrullin oder Nw-Hydroxy-L-Arginin, aber auch durch Messung des cGMPs nachgewiesen werden. Daneben bestehen zwei weitere Möglichkeiten, zum einem die Messung von Nitrat / Nitrit als stabilem Endprodukt des Stickstoffmonoxids (bzw. im Falle des Nitrats auch des Peroxynitrit), zum anderen die Bestimmung des mit Stickstoffmonoxid stöchiometrisch reagierenden Hämoglobins. Eine Sonderstellung nimmt ein neu entwickelter Sensor zur direkten Stickstoffmonoxidmessung ein, mit dem es gelang, die Stickstoffmonoxidproduktion in lebenden Endothelzellen zu bestimmen.
Für Peroxynitrit besteht die Möglichkeit, es über sein Zerfallsprodukt Nitrat oder über das bei der Reaktion mit Tyrosin entstehende Nitrotyrosin, das als ‚footprint‘ bezeichnet wird, zu detektieren. Das Nitrotyrosin wird dann entweder mittels HPLC im Zellhomogenat oder mit einem spezifischen Antikörpers bestimmt (Halliwell 1997). Auch wenn durch den Antikörper immunhistochemische Aussagen auf Einzelzellebene möglich sind, so ist der Nachweis nur post mortem durchzuführen.
Mikroskopischer Nachweis
Da die zelluläre Verteilung der „freien Radikale“ (die z.B. von der NOS produziert werden) in der Regel sehr heterogen ist und die produzierten Mengen an Stickstoffmonoxid, Superoxid, etc. sehr gering sind, bietet die Mikroskopie die Möglichkeit Aussagen auf Einzelzellebene zu treffen.
Generell bietet sich dazu die Fluoreszenzmikroskopie an, wie sie z. B. zum Nachweis des Peroxynitrit durch DHR 123 eingesetzt wird.
Die Verwendung des Fluorogens Dihydrorhodamin 123 (DHR 123), das unter anderem von Peroxynitrit zu einem Fluorochrom, dem Rhodamin 123, oxidiert wird, stellt ein elegantes Verfahren zur Peroxynitritbestimmung dar (Kooy, Royall et al. 1994). Wie auch im Falle des Calcium-Imagings, werden dabei mit einer fluorogenen Substanz (hier DHR 123) beladene lebende Zellen mittels der Fluoreszenzmikroskopie beobachtet (Life-Imaging). Von Vorteil dabei ist, daß Aussagen, auch solche quantitativer Art, über individuelle Zellen oder auch Zelltypen, möglich sind. Demgegenüber sind biochemische Verfahren häufig an die Desintegration der Zellen oder an die Akkumulation von Metaboliten gebunden, wodurch die Aussagekraft bezüglich einzelner Zelltypen und ihrer Funktionszustände, wenn überhaupt, nur eingeschränkt möglich ist.
Das Fluorochrom DCF-H wird weniger durch Stickstoffmonoxid, aber stattdessen sehr effektiv durch Peroxynitrit oxidiert . Zudem erweist sich DCF-H im direkten Vergleich mit DHR 123 als wesentlich sensitiver. Da gerade dem Peroxynitrit ein Großteil der toxischen Wirkungen des Stickstoffmonoxids zugeschrieben wird, und DCF-H als Marker für Peroxynitrit auch in lebenden Zellen geeignet, ergeben sich hier vielfältige Möglichkeiten.
Zellkultur als Modell
Die Induktion der iNOS in Gliazellen spielt im ZNS bei inflammatorischen und neurodegenerativen Prozessen eine entscheidene Rolle, wobei die destruktive Wirkung des von der iNOS produzierten Stickstoffmonoxids bzw. seines Folgeprodukts Peroxynitrit, zunehmendes Interesse findet.
Die In-vivo-Effekte einer erhöhten Stickstoffmonoxidproduktion lassen sich in Mikro-/ Astrogliakulturen simulieren, indem durch Zugabe von LPS/IFN die Expression der iNOS provoziert wird. Mit diesem Zellulturmodell kann untersucht werden, inwieweit sich eine erhöhte Stickstoffmonoxidproduktion auf die Viabilität der Zellen auswirkt und inwiefern diese Zellen durch ihre Ausstattung mit antioxidativen Schutzenzymen möglicherweise gegenüber einer Schädigung resistent sind.
Dabei spielt auch die Ausstattung der Zellen mit dem Enzym Superoxiddismutase (SOD) eine wesentliche Rolle, da diese die Bildung des toxischen Peroxynitrit aus Stickstoffmonoxid und Superoxid durch Konkurrenz um das Superoxid begrenzen können.