Messung reaktiver Stickstoffspezies
Allgemein ist festzuhalten, dass die quantitative Messung von „freien Radikalen“ in biologischen Systemen äußerst schwierig ist, da sich diese durch ihre Reaktionsfähigkeit einer genauen Beobachtung entziehen.
Biochemische Messung
Die Produktion des Stickstoffmonoxids in den Zellen des Körpers kann indirekt durch die Bestimmung der bei der Synthese entstehenden Koprodukte, wie Citrullin oder Nw-Hydroxy-L-Arginin, aber auch durch Messung des cGMPs nachgewiesen werden. Daneben bestehen zwei weitere Möglichkeiten, zum einem die Messung von Nitrat | Nitrit als stabilem Endprodukt des Stickstoffmonoxids (bzw. im Falle des Nitrats auch des Peroxynitrit), zum anderen die Bestimmung des mit Stickstoffmonoxid stöchiometrisch reagierenden Hämoglobins. Eine Sonderstellung nimmt ein neu entwickelter Sensor zur direkten Stickstoffmonoxidmessung ein, mit dem es gelang, die Stickstoffmonoxidproduktion in lebenden Endothelzellen zu bestimmen.
Für Peroxynitrit besteht die Möglichkeit, es über sein Zerfallsprodukt Nitrat oder über das bei der Reaktion mit Tyrosin entstehende Nitrotyrosin, das als ‚footprint‘ bezeichnet wird, zu detektieren. Das Nitrotyrosin wird dann entweder mittels HPLC im Zellhomogenat oder mit einem spezifischen Antikörpers bestimmt (Halliwell 1997). Auch wenn durch den Antikörper immunhistochemische Aussagen auf Einzelzellebene möglich sind, so ist der Nachweis nur post mortem durchzuführen.
Mikroskopischer Nachweis
Da die zelluläre Verteilung der „freien Radikale“ (die z.B. von der NOS produziert werden) in der Regel sehr heterogen ist und die produzierten Mengen an Stickstoffmonoxid, Superoxid, etc. sehr gering sind, bietet die Mikroskopie die Möglichkeit Aussagen auf Einzelzellebene zu treffen.
Generell bietet sich dazu die Fluoreszenzmikroskopie an, wie sie z. B. zum Nachweis des Peroxynitrit durch DHR 123 eingesetzt wird.
Die Verwendung des Fluorogens Dihydrorhodamin 123 (DHR 123), das unter anderem von Peroxynitrit zu einem Fluorochrom, dem Rhodamin 123, oxidiert wird, stellt ein elegantes Verfahren zur Peroxynitritbestimmung dar (Kooy, Royall et al. 1994). Wie auch im Falle des Calcium-Imagings, werden dabei mit einer fluorogenen Substanz (hier DHR 123) beladene lebende Zellen mittels der Fluoreszenzmikroskopie beobachtet (Life-Imaging). Von Vorteil dabei ist, daß Aussagen, auch solche quantitativer Art, über individuelle Zellen oder auch Zelltypen, möglich sind. Demgegenüber sind biochemische Verfahren häufig an die Desintegration der Zellen oder an die Akkumulation von Metaboliten gebunden, wodurch die Aussagekraft bezüglich einzelner Zelltypen und ihrer Funktionszustände, wenn überhaupt, nur eingeschränkt möglich ist.
Das Fluorochrom DCF-H wird weniger durch Stickstoffmonoxid, aber stattdessen sehr effektiv durch Peroxynitrit oxidiert . Zudem erweist sich DCF-H im direkten Vergleich mit DHR 123 als wesentlich sensitiver. Da gerade dem Peroxynitrit ein Großteil der toxischen Wirkungen des Stickstoffmonoxids zugeschrieben wird, und DCF-H als Marker für Peroxynitrit auch in lebenden Zellen geeignet, ergeben sich hier vielfältige Möglichkeiten.
Zellkultur als Modell
Zellkulturen finden in der Grundlagen-Forschung eine breite Anwendung. Insbesondere deshalb, weil sie relativ preisgünstig herzustellen sind.
Es werden im Prinzip 2 Typen unterschieden:
- Primäre Zellkulturen - diese werden meistens aus dem Gewebe von jungen Tieren isoliert. Diese Zellkulturen müssen zunächst einige Tage reifen. Eine Kultivierung solcher Zellen ist nur für einen begrenzten Zeitraum möglich - in der Regel einige Tage bis Wochen.
- Sekundäre Zellkultur (Zelllinien) - diese stammen meist aus menschlichen oder tierischen Tumoren und sind unsterblich (immortalisiert). Sie sind einfacher zu handhaben, allerdings sind ihre Eigenschaften auch noch weiter von den Zellen in einem lebenden Körper entfernt. Und teilweise variieren ihre biochemischen, metabolischen und morphologischen Eigenschaften stark - bzw. sind nicht im Detail bekannt.
Für die Stickstoffmonoxid Forschung haben sich primäre Zellkulturen etabliert. Häufig verwendet man Astrozyten / Mikroglia Mischkulturen, bei denen dann durch Zugabe von Chemikalien / Gewebehormone die iNOS in den Mikrogliazellen induziert wird. So produzieren diese Zellen für einige Tage sehr große Mengen an Stickstoffmonoxid.
Induktion der NO-Synthase
Die Induktion der iNOS in Gliazellen spielt im ZNS bei inflammatorischen und neurodegenerativen Prozessen eine entscheidene Rolle, wobei die destruktive Wirkung des von der iNOS produzierten Stickstoffmonoxids bzw. seines Folgeprodukts Peroxynitrit, zunehmendes Interesse findet.
Die In-vivo-Effekte einer erhöhten Stickstoffmonoxidproduktion lassen sich in Mikro-/ Astrogliakulturen simulieren, indem durch Zugabe von LPS/IFN die Expression der iNOS provoziert wird. Mit diesem Zellulturmodell kann untersucht werden, inwieweit sich eine erhöhte Stickstoffmonoxidproduktion auf die Viabilität der Zellen auswirkt und inwiefern diese Zellen durch ihre Ausstattung mit antioxidativen Schutzenzymen möglicherweise gegenüber einer Schädigung resistent sind.
Dabei spielt auch die Ausstattung der Zellen mit dem Enzym Superoxiddismutase (SOD) eine wesentliche Rolle, da diese die Bildung des toxischen Peroxynitrit aus Stickstoffmonoxid und Superoxid durch Konkurrenz um das Superoxid begrenzen können.